《科學》：分析了40萬個T細胞，發現它們“躺平”的方式竟千差萬別

近年來，癌癥免疫療法（主要是靶向T細胞）在臨床上取得了巨大的成功，極大地延長了癌癥患者的生存期，但是不同類型癌癥的治療效果卻天差地別。

這主要是因為免疫療法的效果不僅取決于癌癥患者的腫瘤免疫浸潤狀況，還與腫瘤免疫微環境中效應T細胞是否更容易變成“耗竭”狀態有關，兩者在不同類型癌癥中均有著較大差異。

一直以來，腫瘤免疫治療領域還沒有關于不同癌癥免疫微環境的系統性比較的研究，隨著單細胞技術以及的TCR測序技術的興起，這層神秘面紗正在被逐漸揭開[1]。

近日，由北京大學的張澤民、季加孚、步召德以及胡學達四位科學家領銜的研究團隊在《科學》發表重要研究成果[2]。

他們利用單細胞技術建立了一個涉及21種癌癥類型、包含397810個T細胞的轉錄組圖譜。他們發現T細胞轉變成耗竭狀態有著多種不同的方式，不同類型癌癥會有特異的方式，并且特定的T細胞亞群與患者的一些屬性有關，例如突變負荷，這表明腫瘤微環境在這其中可能有重要作用。

腫瘤的免疫浸潤淋巴細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，被稱為免疫微環境，而其中影響患者對免疫治療應答情況的是T細胞，一旦大量的T細胞從有功能的效應T細胞狀態進入到失能的耗竭狀態，免疫治療的效果便會大打折扣。

不同癌癥的T細胞耗竭過程是不一致的，有研究發現在黑色素瘤患者中，CD8+T細胞會逐漸線性地從失能前狀態變成耗竭T細胞[3]；而肺癌患者中T細胞則有兩種失能前狀態[4]。這個動態的過程還受到多種轉錄因子的調控。

不僅如此，不同類型癌癥的T細胞特征也不盡相同，例如和肺癌相比，肝癌以及結腸癌的耗竭T細胞比例要更高[5]，而多發性骨髓瘤則幾乎沒有耗竭T細胞[6]。

但目前這方面的研究都只局限于比較3到4種癌癥，并不夠全面。鑒于此，張澤民教授等人建立了一個包含21種癌癥的T細胞的單細胞轉錄組圖譜，一共有來自316例患者的397810個T細胞，這些細胞分別取自腫瘤組織、癌旁組織以及外周血。他們測了其中46.4%的細胞，其余的來自于經過批次校正的已發表數據。

他們從這些T細胞中一共鑒別出了17種CD8+元亞群和24種CD4+元亞群，這些亞群被80%的癌癥類型所共有。

這其中有以前被報道的也有新發現的，包括GZMK+效應記憶T細胞（Tem）、終末分化效應記憶T細胞（Temra）、ISG+T細胞、KIR+NK樣T細胞、組織駐留記憶T細胞（Trm），以及四種耗竭CD8+T細胞（Tex）、三種濾泡輔助T細胞（TFH）和四種調節T細胞（Treg）。

通過組織間的比較，他們發現不同組織中T細胞的組成不一致。腫瘤組織中的CD8+T細胞大部分是耗竭T細胞，而CD4+T細胞則大部分是TNFRSF9+Treg。

為了確定哪些T細胞是潛在的腫瘤反應式T細胞（pTRTs），研究人員對上述類型的T細胞分別計算了數量增殖率（表示數量的多少）和種群擴張率（表示亞群的分布范圍），這兩個值都很大才能認為某種T細胞是腫瘤反應式T細胞，也就是在腫瘤中種群數量和細胞數量都較大。

經過比較，他們認為TFH/TH1、TNFRSF9+Treg、CD8+ISG+T細胞以及四種Tex細胞屬于pTRTs。這也代表了體內抗腫瘤免疫反應的情況。

這些pTRTs屬于CD8+的部分中，Tex是主要類型。于是研究人員結合基因表達和TCR數據解析了T細胞耗竭過程的軌跡。

從整體上看，CD8+T細胞是從初始T細胞分化而來，最終變成Temra或者Tex。但是進一步分析Tex的演化分支，他們發現了兩條不同的演化路徑，一條是初始T細胞到IL7R+記憶T細胞，再到GZMK+T細胞，最后變成終末Tex（P1）；另一條則是IL7R+記憶T細胞到ZNF683+CXCR6+Trm，最后變成終末Tex（P2），這兩種演化路徑在有的腫瘤樣本中甚至同時存在。

之前有假說認為，表達CXCR5和TCF7的祖細胞會造成終末Tex的增加，然而，研究人員在他們的數據中并沒有發現這個現象。

接著他們分析了P1和P2這兩條路徑在不同類型癌癥中的普遍性，發現12種癌癥中有11種的T細胞是通過P1或者P2轉變成Tex的，表明P1和P2是普遍存在的T細胞演化路徑。但仍然有不利用P1和P2進行T細胞演化的腫瘤，例如經過Tc17演化的乳腺癌，說明了T細胞演化的異質性。

上面的分析都是通過比較終末Tex和中間態Tex（例如GZMK+Tex）之間TCR相似程度來確定T細胞的演化路徑，除此之外，研究人員還比較了終末Tex間與非耗竭狀態有關的特征基因的表達模式（同一細胞類型比較）。

他們發現，在卵巢癌中高表達Treg相關轉錄因子FOXP3的終末Tex，與高表達CD8+Tex相關基因CXCL13的終末Tex存在著類內轉化。并且在食道癌和胃腺癌中具有Tc17相關特征的也與表達CXCL13的Tex有著類似的TCR。這些結果都再一次證明了T細胞的演化路徑，同時也說明Tex在不同癌癥中可能有不同的功能。

那么T細胞的耗竭過程到底是怎么發生的呢？

研究人員把在超過80%的癌癥類型中高表達、且編碼轉錄因子的Tex特征基因認定為耗竭相關基因，前十位的基因為TOX、TOX2、RBPJ、ZBED2、PRDM1、VDR、IKZF4、BATF、STAT3、IFI16。其中TOX作為一個早已被識別為T細胞耗竭過程中關鍵的轉錄因子，更是在所有癌癥類型中都有顯著高表達[7]。

盡管Trm和Tem在耗竭過程中有許多共同的上調轉錄因子（TOX、RBPJ以及ETV1），但是不同的演化路徑表達的轉錄因子是不一樣的，例如P1晚期高表達BHLHE40和ZBTB32，而P2晚期則高表達STAT1和IKZF3。

他們還發現了兩個之前未被報道的T細胞耗竭相關轉錄因子——SOX4和FOXP3，表達這兩個基因的T細胞比例在不同類型癌癥中不一樣，表明不同的腫瘤微環境對Tex表型有著不同的影響。

分析完了CD8+T細胞，接著研究人員分析了pTRTs中屬于CD4+的部分。這部分細胞中IFNG+TFH/TH和TNFRSF9+Treg是主要類型。單細胞數據的分析結果顯示這些類型的T細胞是初始T細胞分別分化而來。

更精細化的分析則發現IFNG+TFH/TH是由IL21+TFH形成，在這個過程中，一型免疫反應相關細胞因子和細胞毒性效應分子的表達量都顯著上升，這與之前的研究是一致的[8]。

而Treg的分化過程是從TNFRSF9-到TNFRSF9+的激活過程，與以往報道一致的是，ISG+Treg是中間態細胞類型，說明ISG高表達是CD4+Treg激活過程的重要特征[9]。

研究人員還發現了一些未被報道的TNFRSF9+Treg特征基因，比如在Treg激活軌跡晚期表達的HIVEP1，以往發現的特征基因FOXP3和BATF均是在早期表達。

前面提到過不同腫瘤中T細胞的組成是不同的，研究人員認為癌癥類型的不同在很大程度上造成了T細胞組成的差異，例如食管癌中CD8+Tex的中位比例為26.64%，而多發性骨髓瘤中則為0.15%，其他T細胞類型的比例均在不同類型癌癥中有著較大差異。

除了癌癥類型以外，腫瘤突變負荷甚至一些特定基因（例如FAT1）上的體細胞突變，都能影響T細胞組成。

為了揭示跨癌癥類型的T細胞組成總體特征，研究人員計算了腫瘤之間不同T細胞元亞群比例的關系，他們發現有關聯的T細胞元亞群通常都有著相似的特征基因。

利用有關聯的元亞群之間的特征基因交集，他們識別了基因共有的配體，最終發現TGF-和干擾素可能影響了pTRTs的轉錄以及在腫瘤中的豐度。

最后，這些有關聯的T細胞元亞群的比例，還被研究人員用于將腫瘤樣本進行分類，他們把樣本分成了8類，分別為C1到C8。其中C1和C2的Tex比例更高，C1還有最高比例的TNFRSF9+Treg。C3到C8中的Tex比例較低，而CD8+ZNF683+CXCR6+Trm比例較高。(生物谷Bioon.com）